ARTIGOS ORIGINAIS

RESUMO: Objetivo: analisar a atividade proliferativa das células tumorais do carcinoma colo-retal extirpado. Pacientes e métodos: foram estudados 78 doentes (50 mulheres e 28 homens), com carcinoma colo-retal. A média de idade foi 59,29 anos (28 a 86 anos). Dezesseis doentes foram classificados como Dukes A, 48 como B e 14 como C. A neoplasia estava localizada no colo proximal em 19 enfermos, no distal em 32 e no reto em 27. Os blocos parafinados obtidos das lesões neoplásicas foram submetidos ao estudo imuno-histoquímico com anticorpo anti-PCNA. O estudo histológico foi realizado na margem invasiva mais profunda de cada lesão. O índice de expressão do PCNA foi quantificado pela observação do núcleo celular marcado com anticorpo anti-PCNA em 1000 células na lâmina obtida de cada lesão. A reação foi considerada positiva quando a marcação nuclear ocorreu de modo difuso, com pontos de intensidade variável, ou de modo granular com distribuição homogênea, independente da intensidade. Resultados: houve ausência de diferença significativa entre o índice de expressão do PCNA e a idade, sexo, estadiamento e padrão de crescimento. A localização da lesão no segmento colo-retal e o índice de expressão do PCNA apresentaram diferença significativa apenas entre as lesões situadas no reto e aquelas localizadas no colo proximal (p<0,001). Conclusões: a expressão do PCNA no carcinoma colo-retal não apresenta relação com os diferentes estádios da classificação de Dukes e com o padrão de crescimento infiltrativo ou expansivo da lesão. Os carcinomas retais mostram maior atividade proliferativa que os situados no colo proximal.

UNITERMOS: Neoplasias colorretais, Imunohistoquímica, Antígeno nuclear de células em proliferação.

Os doentes com carcinoma colo-retal podem evoluir de formas diferentes, a despeito da similitude dos seus aspectos clínicos e dos parâmetros anátomo-patológicos dos tumores^1,2, indicando que outros fatores podem participar dos mecanismos de bioagressividade dessas neoplasias. Apesar da extirpação da lesão ser considerada o tratamento padrão para os carcinomas colo-retais, cerca de 40% dos doentes submetidos a extirpações avaliadas como "curativas" morrem devido à recidiva local, loco-regional ou por metástases distantes^2,3.
    A atividade proliferativa é considerada indicador do potencial maligno do carcinoma colo-retal². A informação do padrão da cinética celular da neoplasia colo-retal pode ser útil na complementação da classificação histológica baseada na compreensão do comportamento biológico dos tumores. Diversos estudos descreveram a relação entre o potencial maligno das neoplasias e a cinética da proliferação celular^4,5,6. O aumento da atividade proliferativa do tumor provocaria o desenvolvimento de diversas subpopulações de clones celulares, aumentando a capacidade de invasão, migração e de metástases das lesões malignas^1,7.
    O objetivo deste trabalho foi estudar, por método imuno-histoquímico com anticorpo monoclonal anti-PCNA, a atividade proliferativa celular no carcinoma colo-retal em doentes submetidos a extirpação curativa de suas lesões, relacionando-a com o estadiamento, localização e padrão de crescimento da neoplasia.

PACIENTES E MÉTODOS
Foram estudados 78 doentes (28 homens e 50 mulheres) portadores de carcinoma colo-retal, no estádio A, B ou C da classificação de Dukes¹, operados no Serviço de Gastroenterologia Cirúrgica do Hospital do Servidor Público Estadual de São Paulo "Francisco Morato de Oliveira" (HSPE-FMO), entre 1970 e 1981. Foram considerados fatores de inclusão no estudo a presença de carcinoma colo-retal e a realização de cirurgia com intenção curativa. Doentes com enfermidade disseminada foram excluídos da investigação. O termo curativo foi utilizado para designar a ausência de doença macroscópica ao final do procedimento cirúrgico, confirmado pela presença de margens livres no estudo anátomo-patológico. Os dados clínicos e morfológicos foram obtidos por consulta aos prontuários hospitalares dos enfermos incluídos no estudo. Todos os doentes tiveram o diagnóstico histológico de carcinoma colo-retal confirmado pela revisão das lâminas coradas pela hematoxilina-eosina (HE) e analisadas por patologista experiente.
    Consideraram-se como Dukes A as neoplasias contidas na parede intestinal; como Dukes B, as que se estendiam por toda a parede, atingindo inclusive o tecido adiposo adventício e como Dukes C, aquelas com comprometimento de linfonodos. Os padrões expansivo ou infiltrativo do crescimento neoplásico na margem invasiva foi analisado de acordo com os critérios de Ming⁸. A média de idade foi de 59,29 anos (28 a 86 anos). Dezesseis doentes tiveram suas neoplasias classificadas no estádio A de Dukes, 48 no estádio B e 14 no estádio C.
    A média de idade dos doentes com neoplasia no estádio A da classificação de Dukes foi de 55,67 anos, a dos enfermos com neoplasia no estádio B foi de 60,48 anos e a dos doentes com estádio C foi de 58,0 anos. A neoplasia estava localizada no colo proximal em 19 enfermos, no colo distal em 32, e no reto em 27. A avaliação pré-operatória e a inspeção intra-operatória não demonstraram doença metastática. Todas as lesões colo-retais foram extirpadas.
    Para a realização do estudo imuno-histoquímico, todos os espécimes previamente fixados em formalina e emblocados em parafina foram obtidos do arquivo histopatológico do Serviço de Anatomia Patológica do HSPE-FMO. Obtiveram-se cortes de 4 a 5m de espessura do material incluído em parafina nas lâminas.
    Foi utilizado o complexo estreptavidina-biotina-peroxidase (ABC)⁹ adaptado às condições laboratoriais utilizadas neste estudo. As lâminas foram incubadas com anticorpo monoclonal específico anti-PCNA diluído em tampão PBS durante 16 a 18 horas a 4ºC.
    Em seguida foram lavadas em tampão PBS com três trocas de três a cinco minutos cada e incubadas com anticorpo secundário biotinilado (anti-Ig) diluído em PBS, durante 30 minutos, a 37ºC. Observaram-se as lâminas controles, verificando-se o desenvolvimento de precipitado castanho dourado, como produto final da reação. Finalmente, as lâminas foram contracoradas com hematoxilina de Harris.
    O estudo histológico da expressão celular do PCNA foi realizado na margem invasiva mais profunda da lesão neoplásica. O índice de expressão do PCNA foi quantificado pela observação do núcleo celular marcado com anticorpo monoclonal anti-PCNA em 1000 células em cada lâmina da lesão neoplásica de cada doente. Este processo foi conduzido em microscópio óptico comum munido de lente ocular de 10x e objetiva de 40x, com magnificação final de 400x.
    A avaliação da presença ou não da marcação nuclear pelo anticorpo anti-PCNA das células nas lâminas preparadas da neoplasia de cada enfermo foi conduzida pelo autor, devidamente treinado por patologista experiente com a técnica imuno-histoquímica. Ambos não possuíam conhecimento prévio das características morfológicas, do estadiamento e da localização das lesões neoplásicas colo-retais.
    A reação de expressão celular do PCNA foi considerada positiva quando a marcação nuclear ocorreu de modo difuso ou granular, com pontos de intensidade variável ou com distribuição homogênea, independente da sua intensidade¹.
    Foram utilizados os seguintes modelos estatísticos: média aritmética e desvio padrão, teste da igualdade das médias (t de Student), análise de variância, teste de comparação múltipla de Tukey-Kramer e correlação de Pearson. Em todos os testes, fixou-se em 0,05 por cento o nível para a rejeição da hipótese de nulidade (nível de significância de 95 por cento) de acordo com os padrões correntes em estudos biológicos, assinalando-se com asterisco (*) os valores significativos.

RESULTADOS
Nos 78 enfermos operados de carcinoma colo-retal com intenção curativa classificados nos estádios A, B ou C de Dukes, a expressão do PCNA nas respectivas lesões não apresentou diferença significativa com o estadiamento (p= 0,17) (Tabela 1).

Tabela 1. Estadiamento dos doentes com carcinoma colo-retal, de acordo com a classificação de Dukes e média da porcentagem de expressão do PCNA nas lesões neoplásicas.

Para o estudo estatístico foi considerada a seguinte distribuição das localizações das lesões neoplásicas: colo proximal em 19 doentes, colo distal em 32, e reto em 27 enfermos. Observou-se nos tumores localizados no colo proximal que a porcentagem de expressão do PCNA foi significativamente menor do que nas lesões retais (p<0,001) (Tabela 2) (Figuras 1 e 2). As comparações entre a porcentagem de expressão do PCNA nas lesões neoplásicas das demais localizações do carcinoma colo-retal não apresentaram diferença significativa.

Tabela 2. Localização da lesão no intestino grosso dos doentes com carcinoma colo-retal e média da porcentagem de expressão do PCNA nas lesões neoplásicas.

Nos 78 doentes com carcinoma colo-retal, o padrão de crescimento expansivo ou infiltrativo da margem neoplásica não se associou com a expressão do PCNA nas lesões (p= 0,27) (Tabela 3).

Tabela 3. Tabela comparativa entre o padrão de crescimento tumoral expansivo ou infiltrativo e a média da porcentagem de expressão do PCNA nas lesões neoplásicas.

DISCUSSÃO
Quando comparado com outras técnicas, os métodos imuno-histoquímicos que utilizam anticorpos anti-PCNA possuem a vantagem da simplicidade da sua metodologia de execução. A importância da utilização do PCNA tornou-se atraente devido a sua estabilidade antigênica, viabilidade da sua determinação em material parafinado e em cortes de congelação, e simplicidade da execução do procedimento⁷. Além disso, o grau de expressão do PCNA raramente torna-se indetectável em células fixadas por formaldeído¹⁰.
    Desde que foram publicados na literatura estudos enfatizando a relação entre imuno-reatividade de PCNA com fatores prognósticos, existem controvérsias deste método e questionamentos sobre as possíveis razões para resultados divergentes^11,12.
    O padrão de coloração expressado pelo PCNA é variável na dependência do tipo e da duração da fixação, do tempo de processamento do material histológico, da concentração e do tipo do anticorpo primário, e da metodologia de contagem da célula corada¹³. Apesar da adoção de padrão único de processamento do material histológico, também notamos variação na intensidade de expressão do PCNA nas diferentes lâminas obtidas do tecido neoplásico dos doentes deste estudo. Isto, provavelmente, deveu-se ao fato das lâminas não terem sido preparadas simultaneamente e sim em três lotes processados em diferentes períodos, o que pode ter causado variação suficiente nos tempos de fixação e de processamento para modificar, em algum grau, a intensidade da coloração celular pelo anticorpo anti-PCNA. A visibilização direta da reação nas lâminas permitiu a constatação das boas condições teciduais e, conseqüentemente, melhor contagem das células marcadas pelo anticorpo.
    O padrão heterogêneo de expressão do PCNA foi encontrado entre as amostras e, inclusive, dentro da mesma amostra, achados considerados próprios da imuno-reatividade com PCNA. Isto aconteceu porque o ciclo de células tumorais é assincrônico e a expressão de ciclina, ou seja, o conteúdo de PCNA em cada célula, depende da fase do ciclo em que se encontra. A variabilidade dos aspectos de reação ou da intensidade entre as amostras ou mesmo entre alguns campos foi, por tais motivos, esperada.
    Para a obtenção do índice de expressão do PCNA, foram selecionadas áreas representativas nas margens da invasão neoplásica na parede do segmento colo-retal e a contagem dos núcleos foi realizada em campos contínuos. Em regiões com necrose ou reações desmoplásicas intensas, os campos selecionados foram desconsiderados, independentemente da marcação nuclear. A adoção ou não deste critério pode ser responsável pela maioria das discordâncias entre os resultados dos diferentes estudos.
    Outro critério de avaliação utilizado no presente estudo foi considerar o total de células marcadas como representação da expressão celular do PCNA do tecido neoplásico colo-retal preparado nas lâminas, independentemente da intensidade da coloração desencadeada pela reação entre o PCNA e o anticorpo anti-PCNA¹³. Tal critério foi apontado como o melhor parâmetro para a uniformidade das análises entre os resultados obtidos pelos diferentes autores e o que melhor se relaciona com os aspectos anátomo-patológicos do carcinoma colo-retal. Isto se deve ao fato de que a adoção de diferentes escalas de graduação na avaliação da intensidade da coloração do núcleo da célula pode determinar diferenças pronunciadas nos resultados das observações microscópicas¹³.
    Reação granular intensa observada em alguns doentes deste estudo foi atribuída, também, ao fato de parte expressiva das células neoplásicas encontrarem-se, no momento da fixação com o anticorpo anti-PCNA, na fase S do ciclo celular, quando, devido à intensa síntese de DNA, a atividade da polimerase gama e da proteína auxiliadora PCNA estão mais elevadas^14-17. A média do índice de expressão nas células tumorais com o uso de anticorpo anti-PCNA foi de 61,61%, valor acima dos relatados por outros autores que analisaram a expressão do PCNA no carcinoma colo-retal^13,18,19,20. A possibilidade da presença de relação entre o índice de expressão do PCNA e os diferentes estádios da classificação de Dukes permanece a ser completamente esclarecida. Neste estudo, o índice de expressão celular do PCNA não exibiu diferença significativa com os estádios da classificação de Dukes e, por extensão, com as lesões colo-retais de pior prognóstico (Dukes B e C), o que também foi observado por Al-Sheneber et al.⁶ e Neoptolemos et al.¹⁰. No intuito de avaliar o comportamento biológico mais agressivo da lesão, a falta de relação entre a expressão do índice de PCNA e os diferentes estádios da classificação de Dukes foi prevista, uma vez que o estadiamento de Dukes reflete o grau de penetração do tumor na parede colo-retal e o acometimento ou não dos linfonodos regionais. Por outro lado, o índice de expressão do PCNA traduz o grau de proliferação celular da lesão, independentemente da sua infiltração parietal e do seu envolvimento linfonodal.
    Quanto à localização do carcinoma nas diferentes regiões do segmento colo-retal, o presente estudo mostrou diferença significativa entre os índices de expressão do PCNA das lesões situadas no ceco-ascendente e os das situadas no reto. É possível que este achado reflita o comportamento mais agressivo das lesões retais. Por outro lado, os carcinomas do ceco-ascendente, embora apresentem evolução clínica menos favorável do que os situados no colo esquerdo, provavelmente pelo diagnóstico mais tardio, podem exibir índices de proliferação celular menores, como observamos neste estudo.
    Em relação ao padrão de crescimento infiltrativo ou expansivo do carcinoma colo-retal, não foi observada diferença estatística entre os índices de expressão do PCNA correspondentes.
    A noção de que a proliferação celular pode ser utilizada como marcador importante da expansão neoplásica deve ser melhor avaliada. Portanto, parece importante que estudos ulteriores sejam realizados para definir o papel real da expressão do PCNA como indicador prognóstico para os enfermos portadores de carcinoma colo-retal, o que poderia auxiliar, desta maneira, a seleção de doentes que poderão se beneficiar do tratamento adjuvante.

CONCLUSÕES
A atividade proliferativa celular, medida pelo índice de expressão do PCNA, não apresentou relação com os diferentes estádios da classificação de Dukes e com o padrão de crescimento infiltrativo ou expansivo do carcinoma colo-retal. As lesões localizadas no reto revelaram índice de expressão celular do PCNA significativamente maiores do que as localizadas no colo proximal.

SUMMARY: Objective: to study proliferative activity of tumor cells of extirpated colorectal carcinoma. Patients and methods: a study was made of 78 patients (50 women and 28 men), with colorectal carcinoma. The average age was 59.29 (28 to 86 years). Sixteen patients were classified as Dukes A, 48 as B and 14 as C. The neoplasia was located in the proximal colon in 19 patients, in the distal in 32 and in the rectum in 27. The paraffined blocks obtained from the lesions underwent an immunohistochemical study using anti-PCNA antibody. The histological study was performed on the deepest invasive margin of each lesion. The cell nuclei marked with anti-PCNA antibody were quantified by the observation of 1000 cells on the thin section. Reaction was considered positive when the nuclear marking occurred in a diffuse manner, with variable or granular points of intensity and with homogenous distribution, independent of intensity. Results: there was absence of significant difference between the PCNA expression index and the age, sex, staging in the Dukes classification and the growth pattern. The location of the lesion within the colorectal segment and the PCNA expression index only presented a significant difference for lesions located in the rectum and those in the proximal colon (p<0,001). Conclusions: the expression of PCNA in colorectal carcinoma does not present a relationship with the different stages of the Dukes classification and with the pattern of infiltrative or expansive growth of the lesion. Rectal carcinomas show greater proliferative activity than those in the proximal colon.

UNITERMS: Colorectal neoplasms, Immunohistochemistry, Proliferative celular nuclear antigen.

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René Crepaldi Filho
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Trabalho realizado nos Serviços de Gastroenterologia Cirúrgica e Anatomia Patológica do Hospital do Servidor Público Estadual de São Paulo "Francisco Morato de Oliveira"