ARTIGOS ORIGINAIS

RESUMO: Objetivo: Estudar a distribuição do antígeno carcinoembriônico (CEA) no tecido do carcinoma colorretal, relacionando-a com seu nível sérico, grau de diferenciação celular e classificação de Dukes.
    Pacientes e Métodos: Foram estudados 12 pacientes, sete homens e cinco mulheres, com média de idade de 60,2 anos (58 a 78 anos). Dois doentes foram classificados no estádio A de Dukes, cinco no estádio B e cinco enfermos no estádio C. Amostras de sangue venoso periférico foram colhidas no pré-operatório imediato para a determinação do nível sérico do CEA pela técnica de enzimoimunoensaio. Para identificação do padrão de distribuição tecidual do CEA utilizou-se o método imuno-histoquímico com anticorpo monoclonal anti-CEA. O tipo de distribuição tecidual do CEA foi classificado em apical, citoplasmático e estromal.
    Resultados: A distribuição apical estava presente em quatro pacientes com média do valor sérico do CEA de 4,1 ng/ml, a distribuição citoplasmática ocorreu em três enfermos com média de valor de CEA de 15,5 ng/ml e a estromal com valor médio de CEA de 65,0 ng/ml apresentou-se em cinco pacientes. Dois pacientes Dukes A tiveram distribuição do CEA tipo apical, ao passo que cinco enfermos Dukes B apresentaram o tipo citoplasmático e os cinco pacientes Dukes C exibiram o tipo estromal.
    Conclusões: Os resultados preliminares deste estudo indicaram que a distribuição estromal do CEA tecidual foi associada com maior valor do CEA sérico e estádio mais avançado da classificação de Dukes, ao passo que o tipo apical apresentou menores níveis de CEA sérico e estádio de Dukes menos avançado.

Unitermos: neoplasias colorretais, antígeno carcinoembriônico, prognóstico, imuno-histoquímica, distribuição tecidual.

INTRODUÇÃO
Um dos marcadores tumorais mais estudados em câncer é o antígeno carcinoembriônico (CEA). Descrito em 1965 por Gold e Freeman (12,13) é rotineiramente utilizado como marcador sérico do câncer gastrintestinal, especialmente no carcinoma colorretal. O CEA pertence à família das imunoglobulinas²⁶ e sua função é a de promover a adesão molecular envolvida no processo metastático.³
    Cerca de 60 a 70 % de todos os pacientes com carcinoma de colo apresentam níveis séricos elevados do CEA e, após extirpação da lesão, níveis crescentes do marcador podem sugerir recidiva da neoplasia.^1,5,7,10,18
    Diversas questões permanecem para serem esclarecidas em relação a função do CEA como antígeno associado de tumor e ao uso do nível sérico de CEA como indicador da presença de tumor produtor de CEA.^9,31 A determinação imuno-histoquímica do CEA também foi utilizada para identificar a presença de micrometástases nos linfonodos de pacientes com carcinoma colorretal operados.⁶
    Alguns estudos apontaram contradições na correlação entre o nível sérico do CEA e o conteúdo de CEA do tumor revelado pela análise imuno-histoquímica com anticorpos monoclonais anti-CEA^4,24,25,29 e, também, na correlação entre o conteúdo tecidual de CEA e a gravidade das lesões neoplásicas colo-retais.¹⁹
    O conteúdo de CEA no tecido neoplásico pode constituir parâmetro determinante do sucesso da imunocintilografia²⁰ e da terapia anti-neoplásica associando drogas a anticorpos monoclonais.²⁸
    O estudo imuno-histoquímico do CEA no tecido neoplásico e sua correlação com os valores séricos do mesmo é objeto de estudos, com a finalidade de encontrar a lógica da relação biológica entre o nível sérico CEA e sua fonte tecidual de produção e de estabelecer a dinâmica capaz de explicar o potencial diagnóstico e prognóstico do CEA sérico.¹⁷
    Por outro lado, existe um percentual de carcinomas colorretais que são escassamente produtores de CEA, com níveis séricos baixos do antígeno e nos quais o seguimento com este marcador não seria útil na detecção de recidivas da neoplasia.
    O objetivo deste estudo foi o de analisar os resultados preliminares do tipo de distribuição do CEA no tecido do carcinoma colorretal, relacionando-o com o nível sérico do CEA e com a classificação de Dukes para carcinomas colorretais.

CASUÍSTICA E MÉTODO
Foram estudados 12 pacientes (sete homens e cinco mulheres) portadores de carcinoma colo-retal, com estádio A, B ou C, segundo a classificação de Dukes, operados com intenção curativa no Serviço de Cirurgia Geral do Hospital de Ensino "Padre Anchieta" da Faculdade de Medicina do ABC, no período de 1999 a 2000.
    Consideraram-se como Dukes A as neoplasias que não atingiam a túnica muscular externa da parede intestinal; como Dukes B, as que se estendiam por toda a parede, atingindo inclusive o tecido adiposo adventício e como Dukes C, aquelas com comprometimento de linfonodos.
    A média de idade dos pacientes foi de 60,2 anos (58 a 78 anos). Dois pacientes foram classificados como estádio A de Dukes, cinco como estádio B de Dukes e cinco como estádio C de Dukes (Tabela 1).

Tabela 1 - Idade em anos, sexo, localização e classificação da lesão neoplásica de acordo com o estadiamento de Dukes dos doentes com carcinoma colo-retal

    A neoplasia estava localizada no reto em seis casos, no sigmóide em dois e, em um doente, em cada uma das seguintes localizações: ceco-ascendente, flexura direita, transverso e colo descendente (Tabela 1).
    A avaliação pré-operatória e a inspeção intra-operatória dos pacientes não evidenciaram doença metastática. Todos tiveram o diagnóstico de carcinoma colorretal confirmado pela revisão das lâminas da lesão, realizada por patologista experiente.
    Amostras de sangue venoso periférico foram colhidas no pré-operatório imediato para a determinação da concentração do CEA sérico. Foi utilizada a técnica de enzimaimunoensaio (EIE) e o resultado expresso em nanogramas por mililitro (ng/ml).
    Para a realização do estudo imuno-histoquímico, todos os espécimes previamente fixados em formalina e emblocados em parafina foram obtidos do arquivo histopatológico do Serviço de Anatomia Patológica da Faculdade de Medicina do ABC. Dois cortes de 4µm foram obtidos a partir de cada espécime e corados por meio de técnica imuno-histoquímica com anticorpo monoclonal anti-CEA (Sigma Chemical, EUA).
    Utilizamos o complexo estreptavidina-biotina-peroxidase (ABC) adaptado às nossas condições laboratoriais. As lâminas foram incubadas com anticorpo específico anti-CEA diluído em tampão PBS durante 16 a 18 horas a 4°C. Em seguida foram lavadas em tampão PBS com três trocas de três a cinco minutos cada e incubadas com anticorpo secundário biotinilado (anti-Ig) diluído em PBS, durante 30 minutos, a 37°C. Seguiram-se os seguintes procedimentos: 1. lavagem em tampão PBS com três trocas de três a cinco minutos cada; 2. incubação com o complexo ABC diluído em PBS, durante 30 minutos a 37°C; 3. lavagem em tampão PBS com três trocas de três a cinco minutos cada; 4. revelação e montagem; 5. incubação das lâminas em solução com substrato de diaminobenzidina (DAB) 0,6%, peróxido de hidrogênio (H₂O₂) 0,06%, PBS 100ml e dimetilsulfóxido (DMSO) 1 ml, durante três a cinco minutos a 37°C, ao abrigo da luz.
    Em seguida observou-se , ao microscópio nas lâminas controles, o desenvolvimento de precipitado castanho dourado, como produto final da reação. Finalmente, as lâminas foram lavadas em água corrente e água destilada por três minutos e contracoradas com hematoxilina de Harris por um minuto e em seguida lavadas em água corrente e água destilada. Como passo seguinte, as lâminas foram imersas quatro vezes em água amoniacal (solução de sulfato de amônia 0,5%) e lavadas em seguida em água corrente e destilada. O processo final de desidratação da exposição das lâminas obedeceu ao seguinte esquema: 1. etanol 50%, um minuto; 2. etanol 80%, um minuto; 3. etanol 95%, um minuto; 4. etanol 100%, 3 vezes, um minuto cada.
    A intensidade da marcação foi subjetivamente analisada e a região do tecido neoplásico predominantemente marcada foi avaliada. Este processo foi conduzido em microscópio óptico comum, com a ajuda de lente objetiva de 100x e com magnificação final de 400x.
    A reação foi considerada positiva quando a marcação ocorreu de modo difuso, com pontos de intensidade variável ou granular, com distribuição homogênea, independente da sua intensidade. A avaliação da marcação das células nas lâminas foi conduzida sem o conhecimento prévio em relação às suas características clínicas e morfológicas e à classificação de Dukes.
    Para a leitura do CEA tecidual empregou-se o método qualitativo, utilizando-se critério topográfico^15,17 para distinguir a imunocoloração predominante: a) tipo apical, onde, predominantemente, a margem apical das células neoplásicas estava imunocorada; b) tipo citoplasmático, onde havia predominantemente imunodepósitos corados no interior do citoplasma das células do tumor e c) tipo estromal, onde a imunocoloração dominante ocorria no estroma do tecido neoplásico.
    Uma vez lidas todas as preparações imuno-histoquímicas, assinalou-se em cada uma delas o tipo de imunocoloração levando-se em conta o aspecto morfológico predominante.

RESULTADOS
Quando comparamos o tipo de distribuição tecidual do CEA com seu nível sérico observamos que quatro pacientes com CEA tecidual tipo apical (Figura 1) apresentaram média do nível sérico de 4,1 ng/ml. Três outros pacientes com CEA tecidual tipo citoplasmático tiveram média de CEA sérico de 15,5 ng/ml, ao passo que os cinco pacientes restantes com distribuição tecidual do CEA do tipo estromal mostraram média de CEA sérico de 65,0 ng/ml (Tabela 2).

Tabela 2 - Relação entre o tipo de distribuição tecidual do CEA e a média do nível sérico do CEA dos doentes com carcinoma colo-retal

    Quando cotejamos a classificação de Dukes e os níveis de CEA sérico, verificamos que nos dois pacientes classificados como Dukes A, a média do CEA sérico foi de 8,5 ng/ml; nos cinco pacientes Dukes B, a média do CEA sérico foi de 20,2 ng/ml e nos outros cinco pacientes Dukes C, o valor médio do CEA sérico foi de 47,4 ng/ml (Tabela 3).

Tabela 3 - Relação entre a classificação de Dukes e média do nível sérico do CEA dos doentes com carcinoma colo-retal

    A relação entre o tipo de distribuição tecidual do CEA e a classificação de Dukes mostrou que dois pacientes classificados como Dukes A apresentaram distribuição tipo apical, enquanto que cinco pacientes estadiados como Dukes B exibiram distribuição tipo citoplasmático e outros cinco pacientes Dukes C mostraram distribuição tipo estromal (Tabela 4).

Tabela 4 - Relação entre o tipo de distribuição tecidual do CEA e a classificação de Dukes dos doentes com carcinoma colo-retal.

DISCUSSÃO
O CEA foi originalmente extraído do tecido de intestino fetal humano e de câncer de colo adulto em 1965 por Gold e Freeman,^12,13 e caracterizado como peptídeo glicosado com peso molecular de 200.000 dáltons, cujos determinantes antigênicos localizam-se na porção peptídica da molécula. ^12,13
    A seqüência aminoácida do CEA é semelhante à de membros da superfamília das imunoglobulinas^3,23,26 representada pelas imunoglobulinas, receptores de célula T, receptores de fator de crescimento e moléculas de adesão intercelular³³, todas elas envolvidas em processos de reconhecimento intercelular.³
    O CEA é considerado antígeno associado de tumor derivado do tecido endodérmico devido sua expressão em neoplasias, especialmente as gastrintestinais³⁰ e, por isso, o CEA constitui possível indicador de transformações malignas da mucosa do cólon. Estudos imuno-histoquímicos mostraram que o CEA é produto de células cólicas normais ou neoplásicas^15,22,27 e que a diferença no conteúdo de CEA entre células normais da mucosa colorretal e as neoplásicas é mais quantitativa do que qualitativa.¹⁵
    Goldenberg et al.,¹⁴ usando o método da imunoperoxidase indireta em tecido fixado com formalina e cortado em parafina, a exemplo do empregado no presente estudo, mostraram a presença de CEA em 60% das células do carcinoma de colo e em 14% das células do colo normal, ao passo que Huitric et al.¹⁷, usando cortes de tecido congelado, encontraram CEA em todas amostras do tecido cólico com epitélio normal. É possível que as diferentes metodologias empregadas possam explicar os resultados discrepantes.
    A presença de CEA na superfície basolateral das células epiteliais malignas do colo, correspondente à região estromal da neoplasia, pode explicar o nível sérico elevado do CEA em doentes com carcinoma colo-retal. O CEA nesta localização, diferentemente daquele encontrado nas microvilosidades das células epiteliais cólicas normais, ou seja, na região apical, consegue atingir com mais facilidade a circulação sistêmica. Deste modo, a localização do CEA nas membranas basolaterais e no estroma circulante facilitariam sua passagem para o sangue e linfa.^1,15
    Esse evento, aliado à magnitude da massa neoplásica e ao índice de síntese do CEA, podem ser os responsáveis pela quantidade de CEA encontrado na circulação sangüínea³. Mesmo os tumores bem diferenciados com conteúdo elevado de CEA e padrão de distribuição apical podem apresentar níveis baixos de CEA sérico porque, embora exista secreção de CEA, o antígeno é eliminado no lume intestinal, alcançando a corrente sangüínea em quantidade menor.³ No presente estudo, também se observaram níveis séricos de CEA mais elevados em doentes cujas lesões apresentavam distribuição do CEA predominantemente estromal e níveis menores naquelas com padrão de CEA tecidual tipo apical.
    A coloração estromal poderia ser também explicada pela adsorção ou reação eletrostática do anticorpo primário ou secundário ou ainda da substância reveladora diaminobenzidina (DAB) com os mucopolissacárides próprios do estroma.
    Os resultados da presente casuística mostraram que o padrão tipo apical correspondeu a níveis séricos de CEA menores que 10 ng/ml, ao passo que o tipo citoplasmático e, principalmente, o tipo estromal associaram-se mais freqüentemente com níveis séricos maiores que 10 ng/ml.
    Estes resultados são concordantes com os de Hamada et al.¹⁵ que referiram valores menores que 10ng/ml em sete de um total de oito tumores com tipo apical de distribuição do CEA, e aos achados de Barillari et al.¹ que relacionaram o padrão tipo estromal do CEA tecidual com níveis elevados do CEA sérico, e correlação elevada entre o padrão de tipo apical do CEA e valores do CEA sérico menores que 10 ng/ml.
    Os valores do CEA sérico também podem se relacionar com parâmetros morfológicos. Hamada et al.¹⁵ demonstraram a existência de relação entre a distribuição do CEA nas células do carcinoma colo-retal, grau de diferenciação tumoral e nível sérico de CEA. A maioria dos enfermos com adenocarcinomas bem diferenciados com CEA densamente distribuído pela superfície apical e raramente encontrado nas superfícies basolaterais das células neoplásicas, apresentava níveis baixos de CEA sérico. No entanto, os doentes com adenocarcinoma moderadamente e pouco diferenciados e CEA no estroma e no citoplasma das células neoplásicas exibiram níveis séricos mais elevados. Na presente investigação também observamos que as lesões neoplásicas mais diferenciadas apresentaram padrão de CEA tecidual tipo apical e níveis séricos menores em relação aos carcinomas menos diferenciados.
    O grau de invasão vascular do carcinoma desempenha papel importante como determinante dos níveis séricos de CEA, sobretudo na presença de invasão venosa ³², reconhecida como principal via de drenagem do CEA tecidual para a circulação sistêmica, sendo de importância a invasão pela neoplasia de vasos calibrosos, sobretudo extramurais.
    O estádio do tumor também pode interferir no nível sérico do CEA, uma vez que profundidade de invasão da lesão na parede intestinal pode facilitar o acesso do CEA à corrente sangüínea.^29,32 Este fato é corroborado pela observação clínica de que os doentes com carcinoma colo-retal avançado mostram níveis mais elevados de CEA sérico^{2,8,16,19,24,32}. Os resultados preliminares de nosso estudo também apontaram que quanto mais avançado o estádio da classificação de Dukes, maior o nível sérico de CEA.
    Os níveis de CEA sérico são influenciados pelo ritmo e quantidade de sua produção pelas células do carcinoma.^1,32 A existência da necrose tumoral e a infiltração perineural e/ou perivascular podem elevar os níveis de CEA sérico^15,32. O metabolismo hepático²¹ e o ritmo de eliminação renal do CEA do mesmo modo influenciariam na determinação do seu nível sérico.¹¹
    Os dados preliminares obtidos pelo presente estudo nos impulsionam a prossegui-lo, visando obtenção de resultados mais definitivos do valor da identificação da distribuição tecidual do CEA para explicar seus níveis séricos e o eventual valor prognóstico dessa distribuição no carcinoma colo-retal.

CONCLUSÕES
Os resultados preliminares obtidos por este estudo sugerem a possibilidade da relação entre o tipo dominante de distribuição tecidual do CEA, seus níveis séricos e a classificação de Dukes no carcinoma colorretal. Dada a importância destes parâmetros na avaliação prognóstica, a técnica imuno-histoquímica de identificação da distribuição do CEA tecidual pode constituir elemento prático para explicar os valores do nível sérico do ponto de vista da biologia do CEA, permitindo, deste modo, aumentar a eficácia prognóstica da sua determinação no acompanhamento dos pacientes portadores de carcinoma colorretal.

SUMMARY: Objective: To study the distribution of carcinoembryonic antigen (CEA) in the tissue of colorectal carcinoma, relating this to its level in serum and Dukes classification.
Sample and Method: The CEA distribution in the tissue of colorectal carcinoma was studied in 12 patients: seven men and five women with an average age of 60.2 years (58 to 78 years). Two patients were classified as Dukes stage A, five in B and five in C. Peripheral venous blood samples were collected in the immediate preoperative period for determination of the CEA level using the enzyme immunoassay technique. For the identification of the CEA distribution pattern in the tissue, the immunohistochemical method with anti-CEA monoclonal antibodies was utilized. The CEA distribution type in the tissue was classified as apical, cytoplasmic or stromatous.
Results: Apical distribution was presented in four patients with an average CEA level in serum of 4.1 ng/ml; cytoplasmic in three patients with a CEA level of 5.5 ng/ml and stromatous was seen in five patients with a CEA level of 65.0 ng/ml. The two Dukes A patients had CEA distribution of apical type, while the five Dukes B presented the cytoplasmic type and the five Dukes C had the stromatous type.
Conclusions: The preliminary results suggest that the stromatous CEA type in the tissue is associated with greater CEA levels in serum and a more advanced stage of the Dukes classification, whereas the apical type presented lower CEA levels in serum and a less advanced stage of the Dukes classification.

Key words: colorectal cancer, carcinoembryonic antigen, prognostic, immunochemistry, tissue distribution.

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Endereço para correspondência:
Jaques Waisberg
Rua das Figueiras 550 apto. 134 - Bairro Jardim
09080.300 - Santo André _ Estado de São Paulo
E-mail: jaqueswaisberg@uol.com.br

Trabalho realizado pelas Disciplinas de Cirurgia do Aparelho Digestivo e de Anatomia Patológica da Faculdade de Medicina do ABC _ Santo André.