ARTIGOS ORIGINAIS
AVALIAÇÃO DO DANO OXIDATIVO AO DNA DE CÉLULAS NORMAIS E NEOPLÁSICAS DA MUCOSA CÓLICA DE DOENTES COM CÂNCER COLORRETAL
Evaluation of Dna Oxidative Damage in Normal and Neoplastic Cells of Colonic Mucosa in Patients With Colorectal Cancer
Marcelo Lima Ribeiro1, Denise GonÇalves Priolli2, Daniel Duarte da ConceiÇÃo Miranda3, DemÉtrius ArÇari Paiva3, JosÉ Pedrazzoli JÚnior1, Carlos Augusto Real Martinez2
1. Professor Assistente Doutor do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Universidade São Francisco, Bragança Paulista (SP); 2. Professor Adjunto Doutor do Curso de Medicina da Universidade São Francisco, Bragança Paulista (SP); 3. Acadêmico do Curso de Medicina da Universidade São Francisco, Bragança Paulista, (SP); 4. Mestrando do Curso de Pós-graduação em Nutrição da Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo, (SP); 5. Professor Livre-Docente e Coordenador do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Universidade São Francisco, Bragança Paulista, (SP); 6. Professor Adjunto Doutor do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Universidade São Francisco, Bragança Paulista, (SP).
RESUMO: O estresse oxidativo ao DNA de células da mucosa cólica decorrente de radicais livres de oxigênio presentes na luz intestinal, induz mutações de genes relacionados ao controle do ciclo celular, representando um dos fenômenos iniciais da carcinogênese colorretal. A quantificação do dano oxidativo ao DNA em portadores de câncer colorretal foi pouco estudada até o momento. Objetivo: O objetivo do presente estudo foi mensurar os níveis de dano oxidativo ao DNA de células isoladas da mucosa cólica de doentes com câncer colorretal comparando o tecido normal e o neoplásico e correlacionando-os a variáveis anatomopatológicas. Método: Estudou-se 32 enfermos (19 mulheres) com média de idade de 60,6 ± 15,5 anos, portadores de adenocarcinoma colorretal operados consecutivamente, entre 2005 e 2006. A avaliação do dano oxidativo ao DNA foi realizada pela da versão alcalina do ensaio cometa (eletroforese e gel de célula única), a partir de fragmentos de tecido cólico normal e neoplásico obtidos imediatamente após a extirpação do espécime cirúrgico. Avaliou-se a extensão das rupturas das hélices do DNA com método de intensificação de imagem, em 200 células escolhidas aleatoriamente (100 de cada amostra de tecido) com o programa Komet 5.5. A mensuração da cauda obtida de cada célula (Tail Moment) representava, quantitativamente, a extensão do dano oxidativo ao DNA. A análise estatística das variáveis consideradas foi realizada pelos testes t de Student, qui-quadrado e Kruskal-Wallis, adotando-se nível de significância de 5% (p<0,05). Resultados: Verificou-se em todos os doentes que as células obtidas do tecido neoplásico apresentavam maior intensidade de dano oxidativo ao DNA do que as células oriundas do tecido normal. As células isoladas da mucosa cólica neoplásica apresentavam, em média, extensão de ruptura das hélices do DNA (T.M. = 2,532 ± 0,945) significativamente maior quando comparadas às células isoladas do tecido normal (T.M. = 1,056 ± 0,460) (p=0,00001; I.C.95%: -1,7705 -1.1808). Verificou-se que os doentes pertencentes aos estádios mais precoces da classificação de Dukes e TNM apresentavam maiores níveis de dano oxidativo do que os pertencentes a estádios mais avançados (p=0,04 e p=0,001 respectivamente).Conclusões: As células obtidas do tecido normal de portadores de câncer colorretal apresentam sinais de danos oxidativos ao DNA celular, embora significativamente menores que as células neoplásicas.
Descritores: Estresse Oxidativo, Oxidantes, Ensaio em Cometa, Neoplasias Colorretais.
INTRODUÇÃO
O câncer colorretal (CCR) representa uma
das principais causas de morte por neoplasia em todo
mundo.1,2 Não obstante os recentes avanços obtidos
no diagnóstico precoce e tratamento, os índices de
mortalidade pouco se alteraram3. No Brasil, a evolução
do CCR tem apresentado comportamento semelhante
sendo, atualmente, a quinta causa mais comum de
morte relacionada ao câncer.4 A exemplo do que
acontece em outros países, a incidência do CCR vem
aumentando em comparação a outros tipos de tumores que
acometem o aparelho digestivo.4,5 O aumento da
expectativa de vida, os fenômenos da globalização e,
principalmente, a mudança de hábitos dietéticos fizeram
com que o CCR ganhasse importância crescente no
perfil da mortalidade por câncer em todo o
mundo.6
Desde a publicação do trabalho pioneiro
de Fearon e Vogelstein em 19907, encontra-se bem
estabelecido que o surgimento do CCR, a partir da
mucosa cólica inicialmente normal, é mediado por uma
seqüência de mutações em genes controladores do ciclo
celular (proliferação, diferenciação, adesão e apoptose).
A partir de então, o grande desenvolvimento da
biologia molecular vem permitindo a melhor compreensão
dos mecanismos genéticos e moleculares envolvidos
no desenvolvimento do CCR.7 Contudo, o evento
inicial responsável pela transformação da célula normal
da mucosa cólica em célula neoplásica ainda não se
encontra totalmente esclarecido. Alguns estudos
demonstraram que a hipermetilação da região promotora
de genes bloqueando sua transcrição e o dano
oxidativo ao DNA nuclear (estresse oxidativo), talvez
representem dois dos principais mecanismos relacionados
às etapas iniciais da carcinogênese
colorretal.8,9
O desenvolvimento do CCR encontra-se fortemente associado a hábitos alimentares.
Estudos epidemiológicos indicam que o consumo de carne
vermelha, gordura e álcool aumentam
significativamente o risco da doença, enquanto a ingestão regular de
vegetais e fibras parece diminuir este
risco.10,11,12,13 O consumo de carne vermelha por elevar
consideravelmente a concentração do íon ferro no lúmen
intestinal, determina aumento nos níveis de espécies reativas
de oxigênio (ERO).14,15 O aumento na formação das
ERO na luz intestinal e a exposição contínua da mucosa
a estes radicais livres geram danos oxidativos ao
ácido desoxirribonucléico (DNA) das células epiteliais,
desencadeando o aparecimento de mutações
genéticas.16 Quando essas mutações comprometem genes
responsáveis pelo controle do ciclo celular, podem surgir
clones de células com autonomia proliferativa,
representando o mecanismo inicial da carcinogênese colorretal.
É sabido que a agressão crônica à
mucosa cólica promovida pelas ERO, provoca o
aparecimento de processo inflamatório crônico que, alterando
progressivamente a arquitetura normal do epitélio
cólico, promove o surgimento de áreas com graus
crescentes de displasia tecidual, e alteração histológica
precursora do CCR.17 Algumas evidências reforçam essas
suposições merecendo destaque, à estreita relação
existente entre as doenças inflamatórias intestinais
crônicas, representadas pela colite ulcerativa e
enfermidade de Crohn, e o CCR.17 Nos doentes portadores
dessas enfermidades, quanto mais intensa e duradoura
for à agressão oxidativa ao epitélio mucoso do cólon,
maior será o risco do surgimento da
neoplasia.17
Até o momento, a mensuração dos níveis
de estresse oxidativo ao DNA envolvia técnicas
bioquímicas sofisticadas que necessitavam de considerável
quantidade de tecido para a sua correta quantificação.
Dessa forma, em virtude dos limites relacionados com a
obtenção de material suficiente para análise, essas
técnicas não podiam ser aplicadas em pequenas
quantidades de tecidos, como aqueles obtidos durante
procedimentos endoscópicos. Por esta razão,
encontram-se poucos estudos que quantificaram o dano oxidativo
ao DNA em portadores de CCR comparando os tecidos normais e
neoplásicos.18 Com o advento da técnica
da eletroforese em gel de célula única (ensaio do
cometa) é possível quantificar-se os níveis de danos
oxidativos ao DNA em uma célula isolada. O ensaio do
cometa permite a medida dos níveis de estresse oxidativo
em pequenos fragmentos de tecido, possibilitando o
estudo comparativo entre células normais e neoplásicas
da mucosa cólica nos diversos estágios do
desenvolvimento do CCR.18 Esta possibilidade torna o método
atraente na quantificação do nível de dano oxidativo
comparando tecido normal, pólipos com diversos graus
de displasia e tecido neoplásico. A possibilidade
de quantificar o dano oxidativo em pequenos
fragmentos teciduais permite ainda avaliar a eficácia de
agentes antioxidantes, tais como os inibidores de COX-2,
na prevenção da agressão oxidativa ao DNA celular
nas diversas etapas da seqüência adenoma-carcinoma.
Diante dessas evidências é de
fundamental importância compreender o papel das ERO no
dano oxidativo ao DNA das células da mucosa cólica.
Assim sendo, objetivo do presente estudo foi quantificar
e comparar os níveis de estresse oxidativo ao DNA
das células normais e neoplásicas isoladas da mucosa
do intestino grosso de doentes portadores de CCR.
MÉTODO
A realização do presente estudo recebeu
aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da
Universidade São Francisco tendo todos pacientes, assinado
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido após
serem informados de todas as etapas da pesquisa.
1. Casuística:
Foram estudados de modo prospectivo, 32 enfermos (19 mulheres), com média de idade de 60,6
± 15,5 anos, portadores de adenocarcinoma do cólon
e reto, operados com intenção curativa por uma
mesma equipe cirúrgica, entre julho de 2005 e abril de
2007. Foram excluídos os doentes com CCR
hereditário (polipose adenomatosa familiar e câncer colorretal
hereditário não polipóide), portadores de CCR
associado à doença inflamatória intestinal e, aqueles
submetidos a tratamento radioterápico ou
quimioterápico neoadjuvante. Os enfermos selecionados para o
estudo foram submetidos ao estadiamento
clínico, laboratorial e por exames de imagem segundo as
diretrizes recomendadas pela Associação Médica
Brasileira.19
As características clínicas e
anatomopa-tológicas dos doentes encontram-se relacionadas
na Tabela 1.
2. Coleta do Material
Imediatamente após a extirpação do
espécime cirúrgico foram retirados três fragmentos de
tecido normal da margem proximal de ressecção
cirúrgica. Da mesma forma, foram colhidos três fragmentos
de tecido neoplásico obtidos da periferia do tumor. Os
fragmentos obtidos foram acondicionados em
recipiente apropriado, e imediatamente enviados ao
Laboratório de Biologia Molecular onde eram resfriados a -
80ºC, até o momento da realização do ensaio do cometa.
3. Exame Anátomo-Patológico
O estudo macroscópico dos espécimes
extirpados analisou a localização do tumor, o tamanho
e tipo de crescimento. Na realização do
estudo histopatológico, todos os espécimes cirúrgicos
previamente fixados em solução de formol a 10%,
foram emblocados em parafina. Foram obtidos de cada
bloco seis cortes de 4mm, sendo três da margem proximal
de ressecção, e três outros da periferia do tumor
para obtenção de tecido com e sem neoplasia, sendo
corados pela técnica da hematoxilina-eosina para
diagnóstico microscópico e avaliação do nível de invasão
na parede intestinal, tipo histológico, grau de
diferenciação celular, presença de invasão angiolinfática ou
neural e número de linfonodos comprometidos.
O estadiamento dos doentes foi feito segundo as
classificações de Dukes e TNM.
4. Ensaio do Cometa
Para a realização do ensaio do cometa
foram utilizados: um fragmento obtido do tecido neoplásico
e um fragmento de tecido normal. A análise do
dano oxidativo ao DNA das células da mucosa cólica
foi feita de acordo com método anteriormente
descrito.20 Resumidamente, as amostras foram incubadas em
3 ml de uma solução de Hank's
(HBSSÒ), contendo 5,5 mg de proteinase
KÒ e 3 mg de colagenase III por
45 minutos a 37ºC para a liberação das células. A
seguir, foram então, re-suspendidas em 10 ml de HBSS
e centrifugadas para o isolamento das células.
Alíquotas foram retiradas e a viabilidade celular avaliada,
sendo selecionadas para análise somente se
apresentassem viabilidade superior a 75 por cento.
A versão alcalina do ensaio do cometa foi
realizada de acordo com Ladeira et
al.21 De forma resumida, 15 ml da suspensão celular previamente
obtida foram misturados a agarose low melting
point 0.5 % (Promega, Invitogen), postos sobre uma lâmina e
cobertos com uma lamínula. Em seguida estas
foram imersas em uma solução de lise gelada (2,5 M
NaCl, 100 mM EDTA, 10mM Tris, 1% SDS, pH 10 com 1% Triton X-100 e 10% DMSO) e permaneceram a
4ºC por 12 horas. Subseqüentemente, foram expostas a
um tampão alcalino (1 mM EDTA e 300 mM
NaOH, pH~13,4) por 40 min a 4ºC. A eletroforese foi
realizada neste tampão a 4ºC por 30 min a 25V e 300
mA. Após a realização da eletroforese, as lâminas
foram neutralizadas (0,4 M Tris, pH 7,5), coradas com
SYBR SafeÒe analisadas com um microscópio
de fluorescência. Duzentas células foram
aleatoriamente selecionadas (100 de cada amostra tecidual) e
analisadas individualmente utilizando-se o
software Komet 5.5Ò.
Com o auxílio do software Komet 5.5 foi
obtido o valor da extensão da cauda do cometa
(Tail Moment), sendo seus valores médios
determinados. Segundo o manual do fabricante, este é definido
como o produto do DNA da cauda e a distância média
da migração da cauda. O tamanho da cauda de
cometa reflete a extensão das rupturas das hélices de
DNA (estresse oxidativo), e pode ser quantificado por
métodos de intensificação de imagem e
análise computacional. (Figura 1)
Figura 1 - Avaliação dos níveis de estresse oxidativo
("Tail Moment"), por meio da eletroforese em gel de célula única (ensaio do cometa). A - Célula normal; B - Célula com dano oxidativo moderado; C - Célula com dano oxidativo grave. |
5. Análise estatística
Os dados obtidos foram analisados usando o programa estatístico SPSS
13.0Ò. Adotou-se o teste
"t" de Student, e as razões de chance e intervalos de
confiança de 95%, na comparação entre os valores
médios obtidos entre o tecido normal e neoplásico. Foram
utilizados testes de tendência (qui-quadrado) e análise
de variância (Kruskal-Wallis) para variáveis
não paramétricas (tipo histológico, grau histológico,
estádio), adotando-se como normal, o valor igual ou inferior
a média do dano oxidativo encontrado no tecido normal,
e como alterados valores maiores que a média
encontrada no tecido normal. Adotou-se 5% (p<0,05) como
coeficiente para rejeição da hipótese de nulidade.
RESULTADOS
A Figura 2 mostra os valores médios do
Tail Moment (TM) mensurados em 100 células,
comparando, em toda a casuística, o tecido normal e
o neoplásico. Os resultados demonstraram que em
todos os doentes ocorria maior intensidade de dano
oxidativo no tecido neoplásico quando comparado ao tecido
normal. Ao avaliar-se a intensidade de dano oxidativo
no tecido normal, encontrou-se valores de TM médios
de 1,056 ± 0,460, enquanto no tecido neoplásico de
2,532 ± 0,945. A Figura 3 mostra que ao comparar-se o
valor médio de TM entre tecidos normal e com câncer,
existia intensidade de dano significativamente mais
elevada no tecido neoplásico (p=0,00001; I.C.95%:
-1,7705 a -1.1808).
Figura 2 - Níveis de dano oxidativo ao DNA nos tecidos normal
e neoplásico na casuística estudada. |
Figura 3 - Gráfico de médias comparando a intensidade de
dano oxidativo ao DNA, mensurado pelo Tail Moment, nos tecidos normal e neoplásico. |
A tabela 2 mostra a relação entre os
valores médios de TM no tecido neoplásico e as variáveis
analisadas. Não se encontrou relação entre a
intensidade de dano oxidativo quando se considerou o gênero
dos doentes (p=0,32). Quando se analisou doentes com
idade acima e abaixo dos 70 anos, verificou-se
tendência a maior intensidade de dano nos enfermos menores
de 70 anos (p=0,001). Os tumores localizados após
a flexura esplênica (cólon distal) apresentaram
maior tendência a dano oxidativo que os localizados no
cólon proximal (p=0,001). A média dos valores de TM
no tecido neoplásico ao considerarem-se tumores
produtores de muco e tumores não produtores, revelou
maior tendência a dano oxidativo nos portadores de
tumores não mucinosos (p=0,001). Ao mensurarem-se
os valores de TM em relação ao grau histológico
constatou-se que a piora do grau histológico
encontrava-se relacionada à menor intensidade de dano
oxidativo. (p=0,03). Enfermos que não apresentavam
invasão angiolinfática e neural apresentavam maior
tendência a dano oxidativo (p=0,001 e p=0,007
respectivamente).
Ao analisar-se a variação dos níveis de
dano oxidativo em relação ao estadiamento, foi possível
verificar que no tecido neoplásico dos enfermos
pertencentes ao estádio A da classificação de Dukes
havia, em média, TM = 3,83±0,36; nos do estádio B, TM
= 2,31±0,75 e nos do estádio C, TM =
2,48±1,02 (p=0,04). Da mesma forma, quando se comparou o valor
médio de TM entre estádios precoces e estádios
avançados (III e IV) da classificação TNM (I e II),
encontrou-se valores de TM de 2,59±1,01 e
2,49±0,92 respectivamente (p=0,03; IC _0,6082 a 0,8025).
Encontrou-se variância decrescente na intensidade de dano
oxidativo com a piora do estadiamento (p=0,001)
DISCUSSÃO
As ERO, também conhecidas como radicais livres de oxigênio, vêm sendo implicadas como
fator etiopatogênico de diversas enfermidades que
acometem o homem.22 No adulto, o estresse oxidativo
encontra-se relacionado ao surgimento de
enfermidades crônico-degenerativas tais como doenças
cardiovas-culares e inflamatórias
intestinais.17,22 A avaliação
do papel representado pelas ERO nas etapas iniciais
da carcinogênese humana vêm mostrando que elas
promovem processo inflamatório crônico à mucosa
cólica gerando alterações no metabolismo celular normal,
em proteínas intracelulares e dano oxidativo ao DNA
celular. O estresse oxidativo desencadeado pelas
ERO induz instabilidade genômica em diferentes
regiões cromossômicas, ocasionando mutações genéticas
com conseqüente possibilidade de ganho proliferativo
celular descontrolado.22
Feanton, em 1894, descreveu pela primeira vez a produção de ERO a partir da dissociação do
peróxido de hidrogênio em radicais de hidroxila, em uma
reação catalisada pelo íon
ferro.23 Uma melhor compreensão da ação deletéria das ERO ocorreu após a
identificação da enzima superoxidodismutase que apresenta
importante ação
antioxidante24.
As ERO possuem na órbita de seu átomo
elétrons não pareados, e são formadas a partir da
adição ou perda de elétrons em um átomo
neutro.25 Normalmente, as ERO são produzidas a partir do
metabolismo aeróbico celular, da atividade bacteriana em
substratos alimentares no interior da luz intestinal e,
principalmente, pela agressão inflamatória à mucosa
cólica.17 Das ERO, as que apresentam maior potencial agressivo
para as células da mucosa intestinal são o superóxido
(O2-) e a hidroxila
(OH-), resultantes da dissociação
do peróxido de hidrogênio
(H2O2).17 Durante o
metabolismo as células da mucosa intestinal formam ERO
pela adição de um elétron ao íon
O2, representando a etapa inicial de sua formação a partir da redução do
oxigênio molecular. A superoxidodismutase, catalisando a
reação, faz com que duas moléculas de
O2- reajam com dois átomos de hidrogênio formando o
H2O2. No interior na luz intestinal, por meio da reação de
Feanton, catalizada pelo íon
Fe++, o H2O2 forma o radical
OH-, a mais reativa entre todas as
ERO.24
As ERO são eletrofílicas, com atividade
altamente reativa, atacando substâncias com alta
densidade de elétrons tais como as bases nitrogenadas
que formam os ácidos nucléicos que compõe a
molécula de DNA.26 Dentre os mecanismos mais bem
estudados de dano oxidativo ao DNA encontra-se a
oxidação da base nitrogenada
guanina.27 Nesta reação existe
a incorporação de um radical
OH- no carbono 8 da molécula da guanina, formando a 8-hidroxi-guanina
(8-OHdG) (Figura 4).27
Figura 4 - Formação de 8OHdG pelas espécies livres de oxigênio a partir da guanina (2'-dG). |
Durante o processo de duplicação do DNA,
a guanina normalmente pareia-se com a citosina
(G-C). Contudo, durante o processo de duplicação do
DNA, caso ocorra a formação da 8-OHdG, por um
fenômeno conhecido como transversão, a guanina oxidada
pareia-se, de forma errônea, com uma molécula de timina
(G-C ®G-T). Na eventualidade de não haver
correção, por meio das proteínas de reparo do DNA, no
local onde ocorreu a inserção da 8-OHdG, poderá
haver transcrição equivocada, com a conseqüente
formação de uma proteína defeituosa. Caso esta proteína
mutante se encontre relacionada aos mecanismos de
controle do ciclo celular, a célula poderá ganhar
autonomia proliferativa, formando um clone de células
mutantes com características semelhantes. Este desequilíbrio
do ciclo celular, com favorecimento da proliferação
em detrimento da apoptose, poderia se constituir na
explicação molecular para o início de formação dos
pólipos. Com o progredir da agressão oxidativa ocorrem
sucessivas mutações em genes supressores de tumor
ou oncogenes (APC, k-ras, DCC, p53) promovendo o crescimento celular anárquico (displasia tecidual)
culminando com o aparecimento do CCR. À medida
que o estresse oxidativo persiste as células neoplásicas,
em virtude do acúmulo de mutações em genes que
controlam o ciclo celular, perdem a capacidade de
apoptose, tornando-se dessa forma menos sensíveis a
novas agressões oxidativas.28
A quantificação da 8-OHdG tem sido
usada como método para mensurar os níveis de dano
oxidativo ao DNA. Durante os últimos anos diferentes
métodos bioquímicos e analíticos foram desenvolvidos com
o objetivo de avaliar a presença do estresse
oxidativo nos tecidos humanos. A quantificação do
estresse oxidativo em bases do DNA apresenta grande
interesse, por permitir a melhor compreensão do seu
papel nas diferentes etapas do processo de
carcinogênese.18 Habitualmente, a quantificação do dano oxidativo
nuclear envolve técnicas de extração do DNA dos
tecidos e análise por cromatografia a gás ou
técnicas imunohistoquímicas. Geralmente estas técnicas
não podem ser aplicadas para pequenos fragmentos de
tecidos obtidos por biópsia em virtude dos limites
relacionados à sua metodologia. Por esta razão,
encontram-se poucos estudos que analisaram
comparativamente, a intensidade de estresse oxidativo nas diversas
etapas evolutivas do processo de carcinogênese
colorretal.18 A possibilidade de mensurar os níveis de dano
oxidativo em pequenos fragmentos de tecido da mucosa
cólica em diversos estágios da carcinogênese, poderia
contribuir para melhor compreensão do papel
representado pelas ERO em todas as etapas do desenvolvimento
do CCR.
Singh et al. desenvolveram, em 1988, uma
técnica simples, capaz de detectar os níveis de
danos oxidativos ao DNA em uma célula
isolada.29 Esta técnica foi inicialmente chamada de
"eletroforese em gel de célula
única" sendo hoje popularmente
conhecida como "ensaio do
cometa".29 Neste contexto, o
ensaio do cometa permite de maneira simples e precisa
a quantificação dos níveis de dano oxidativo ao DNA
de pequenas quantidades de tecido obtidos a partir
de biópsias.30 Talvez uma de suas maiores vantagens
seja possibilitar a quantificação do dano ao DNA de
uma única célula, o que permite a interpretação
individualizada do estresse oxidativo à mucosa cólica nos
diversos estágios da
carcinogênese.30 A possibilidade
de quantificar o dano oxidativo nos vários estágios
da carcinogênese permitiria ainda, a avaliação da
eficácia de diversos agentes antioxidantes, tais como
os antiinflamatórios inibidores da COX-2, na proteção
do DNA contra mutações ocasionadas pelo
estresse oxidativo.
A mensuração da intensidade de dano
oxidativo é essencial para o melhor entendimento dos
mecanismos etiopatogênicos do estresse oxidativo e seus
efeitos moleculares. A agressão inicial à mucosa
cólica normal surge a partir de um processo inflamatório
formador de ERO que desencadeia mutações
progressivas em genes reguladores do ciclo celular. A
possibilidade de quantificar os níveis de dano oxidativo
nas células submetidas a diferentes graus de
inflamação torna-se uma estratégia interessante para avaliar a
responsabilidade das ERO nas várias etapas
da carcinogênese. A relação entre estresse oxidativo
e inflamação já foi anteriormente descrita, quando
se verificou aumento na intensidade de dano oxidativo
ao DNA quanto mais duradouro e intenso fosse o
processo inflamatório, determinando o aparecimento de
lesões displásicas possivelmente relacionadas
ao surgimento do câncer.31 Estudos experimentais
demonstraram que em camundongos silenciados para o gene Il-10, aproximadamente 60% deles
desenvolveram tumores no cólon proximal após um período
inicial de intenso processo inflamatório na mucosa
cólica.32 Da mesma forma, 30% dos camundongos
silenciados simultaneamente para os genes Il-2 e b2
microglobulina desenvolveram adenocarcinoma no cólon, após
longo período de exuberante processo inflamatório, com
índices de mutações nos genes APC e p53 de 100 %
e 60% respectivamente.33 Como a mutação da
proteína APC é considerada um evento inicial no processo
de carcinogênese colorretal, determinando um
descontrole da proliferação celular, é possível que a
acentuada formação de ERO, promovendo agressão
inflamatória crônica, possa estar relacionada aos altos índices
de mutação encontradas neste gene. Estudos
comparando o tecido inflamatório e o neoplásico em
portadores de colite ulcerativa, mostraram que o espectro de
mutações do gene p53 é dominado pelo fenômeno de
transição de bases do DNA provavelmente
desencadeado pela formação de
ERO.34 Recentemente, Oliva et al demonstraram níveis duas vezes mais elevados de
8-OHdG no tecido neoplásico de portadores de
CCR quando compararam com o tecido
normal.35 Constataram ainda, avaliando a expressão de vários genes
relacionados à carcinogenese colorretal, que em 71%
dos doentes que apresentaram altos níveis de
estresse oxidativo, o gene p53 apresentava elevados índices
de mutação destacando a importância da relação
entre estresse oxidativo e mutações do gene
p53.35 Dessa maneira é possível que a ação das ERO sob o
gene p53 também determinem mutações provocando
alterações no mecanismo de controle da apoptose
celular programada.
Os resultados do presente estudo encontram-se de acordo com os achados da literatura, quando
se observou no tecido neoplásico níveis de dano
oxidativo ao DNA significativamente maiores quando
comparados ao tecido normal.36 Contudo, deve-se ressaltar,
que no tecido normal já era possível identificar algum
grau de estresse oxidativo o que reforça a importância
das ERO nas etapas iniciais da agressão tecidual. É
provável que nestes tecidos, eventuais erros de
pareamento provocados pela formação de 8-OHdG tenham
sido reconhecidos pela proteína p53 normal e corrigidos
por meio de proteínas de reparo, impedindo a mutação
de genes responsáveis pelo controle da proliferação
celular.18 Quando o dano oxidativo excede a
capacidade de correção do DNA pelas proteínas de reparo, a
proteína p53 normal reconhece o dano induzindo a
apoptose celular e impedindo a formação de um clone de
células mutantes. Já se demonstrou a importante relação
existente entre deficiências no sistema de reparo e
aumento nos níveis de dano oxidativo ao DNA em
portadores de CCR.37 Atualmente, estamos analisando pela
técnica da PCR em tempo real (RT-PCR), no mesmo
grupo de doentes da presente casuística, a expressão de
genes relacionados ao sistema de reparo e apoptose
(hMLH1, hMSH2, BCL2, BAX e p53) nos tecidos normais
e neoplásicos com o objetivo de relacioná-los aos
níveis de estresse oxidativo.
Quando se relacionou a intensidade de dano oxidativo com o gênero, de modo diferente da
literatura, não foi possível encontrar-se diferenças
significantes (p=0,32).18 Ao avaliar-se a intensidade de dano em
relação à localização da neoplasia verificou-se que
tumores localizados após a flexura esplênica
apresentavam maior tendência a dano quando comparados
aos localizados antes da flexura esplênica (TM
2,56±0,96 e TM 2,32±0,94, respectivamente; p=0,001). É
possível que estes resultados encontrem-se relacionados
às diferentes vias de carcinogênese, quando se
consideram tumores localizados antes e após a
flexura esplênica. É sabido que o processo de
carcinogênese dos tumores localizados no cólon distal
encontra-se relacionado à seqüência adenoma-carcinoma, onde
a mutação do gene p53 é um evento comum.
Tumores localizados no cólon proximal são considerados
câncer "de novo", por desenvolverem-se a partir da
mucosa cólica habitualmente desprovida de pólipos estando
geralmente associados a mutações em proteínas de
reparo.38 Estudos anteriores demonstraram que tumores
localizados no cólon distal, apresentam maior
possibilidade de mutações da proteína p53 quando
comparados aos do cólon
proximal.38 Análises realizadas em
tecidos submetidos a agentes indutores de estresse
oxidativo, vêm confirmando a relação existente entre níveis
aumentados de 8-OHdG e mutações da proteína
p53.39 Como existe relação entre estresse oxidativo e
mutação do gene p53, é possível que tumores de localização
distal apresentem maior intensidade de dano pela
impossibilidade da sua correta identificação por cursarem
com maiores índices de mutações no gene p53.
Quando se considerou o tipo histológico
da neoplasia verificou-se maior intensidade de
estresse oxidativo nos tumores não produtores de muco.
Estes achados talvez se encontrem relacionados ao pior
grau histológico, habitualmente encontrado nos tumores
produtores de muco. Embora não existissem
diferenças significantes quando se comparou o valor médio de
dano oxidativo nos diferentes graus histológicos,
verificou-se que tumores bem diferenciados apresentavam
tendência a danos mais elevados que os
moderadamente e pouco diferenciados (p=0,03). É possível que a
célula neoplásica indiferenciada, acumule um número
tão grande de mutações que esteja menos susceptível
a novas agressões oxidativas.28 Os resultados iniciais
de um estudo recém iniciado onde comparamos os
níveis de estresse oxidativo no tecido normal em pólipos e
no CCR, vem demonstrando maior intensidade de dano nos pólipos quando comparado ao tecido normal e
ao neoplásico. É possível que nas etapas iniciais da
formação do pólipo, onde a agressão inflamatória inicial
é o evento predominante, exista maior formação de
ERO traduzida pelos valores mais elevados de dano
oxidativo. Nessa fase, as proteínas de reparo exercendo seu
papel de correção do DNA danificado pelo
estresse oxidativo, ainda conseguem reparar o DNA evitando
o surgimento das mutações relacionadas à formação
da célula neoplásica. No tecido neoplásico, onde o
processo inflamatório já não é tão exuberante, talvez
ocorra menor intensidade de dano oxidativo, traduzido
pelos menores valores de TM quando comparado ao
tecido adenomatoso. Estudos vêm mostrando que, as
células neoplásicas como já possuem inativação ou deleção
de genes supressores de tumores e/ou ativação
de oncogenes que determinam autonomia proliferativa,
se tornam muito menos dependentes da agressão
oxidativa externa quando comparadas às células
normais.28 Resultados semelhantes foram encontrados por
estudos que compararam os níveis de dano oxidativo ao
DNA em portadores de gastrite e neoplasia gástrica
associada ou não à presença da
Helicobacter pylori.40
Ao analisar-se a intensidade do dano oxidativo segundo o estadiamento TNM e a classificação
original de Dukes, verificou-se que os doentes
pertencentes aos estádios precoces das classificações
apresentavam valores médios mais elevados que os
classificados em estádios mais avançados. É possível que
tumores menos avançados em virtude do menor número
de mutações em genes relacionados à capacidade de
adesão celular e angiogênese ainda sejam passíveis
de sofrerem ainda agressão oxidativa. Nos tumores
com estádios mais avançados as mutações existentes
já conferem autonomia proliferativa, imortalidade
celular, suprimento sangüíneo adequado e capacidade de
migração celular, condições necessárias para a
disseminação da doença independentemente da
necessidade de novos danos ao DNA.
O presente estudo confirmou a validade da eletroforese em gel de célula única na
determinação dos níveis de estresse oxidativo ao DNA em
doentes com CCR. A quantificação do estresse oxidativo
foi realizada a partir de pequenas amostras de tecido
que poderiam ter sido facilmente obtidas em exames endoscópicos. Portanto, trata-se de
metodologia exeqüível que permitiria a mensuração do dano
oxidativo ao longo de todas as etapas do processo de
desenvolvimento do CCR.
Estudos com maior número de doentes, correlacionando o estresse oxidativo a mutações
em cada um dos genes envolvidos na formação do
CCR ainda são necessários para avaliar de forma mais
precisa o papel desempenhado pelas ERO em cada uma das etapas da carcinogênese. Com o advento de
técnicas de microarray e tissue
microarray que possibilitam o estudo simultâneo da expressão de um
grande número de genes ou das proteínas mutantes por
eles formadas, associadas a métodos de quantificação
do estresse oxidativo, tais como o ensaio do cometa,
será possível compreender melhor o papel
desempenhado pelas ERO na formação do CCR. A avaliação dos
níveis de dano oxidativo, nas diferentes etapas
da carcinogênese colorretal, apresenta grande
interesse por permitir a avaliação da eficácia de
substâncias antioxidantes, que poderiam ser empregadas
como medidas preventivas da agressão oxidativa inicial
à mucosa cólica.
CONCLUSÃO
Os resultados encontrados no presente estudo permitem concluir que as células da mucosa
cólica normal, em portadores de CCR, já apresentam
danos oxidativos ao DNA, embora significativamente
menores que as células do tecido neoplásico.
ABSTRACT: Oxidative stress on mucosal cells of the colon, resulting from the action of free radicals present in the intestinal lumen, represents one of the initial phenomena in colorectal carcinogenesis, because it may induce gene mutations relating to cell cycle control. Quantification of the oxidative damage to the DNA in colorectal cancer patients has been little studied so far. Objective: To measure the levels of oxidative damage to the DNA in cells isolated from the colon mucosa in colorectal patients, and to compare normal and neoplastic tissues and make correlations with anatomopathological variables. Method: Thirty colorectal adenocarcinoma patients (eighteen women) of mean age 60.6 ± 15.5 years who consecutively underwent operations performed by the same surgical team between 2005 and 2006 were studied. The oxidative damage to the DNA was evaluated by means of the alkaline version of the comet assay (single-cell gel electrophoresis), from fragments of normal and neoplastic colon tissue that were obtained immediately after removal of the surgical specimen. The extent of breakages of the DNA helices was assessed using an image intensification method, on 200 randomly chosen cells (100 from each tissue sample), by means of the Komet 5.5 program. The Tail Moment (T.M) measured in each cell quantitatively represented the extent of the oxidative damage to the DNA. The statistical analysis on the variables considered was performed by means of the Student t, chi-squared and Kruskal-Wallis tests, with a significance level of 5% (p<0.05). Results: It was found that, for all the patients studied, the cells obtained from the neoplastic tissue presented oxidative damage to the DNA that was greater than in the cells from normal tissue. The cells isolated from the neoplastic mucosal tissue of the colon presented extension of DNA strand breakage significantly greater (T.M. = 2.532 ± 0.945) than did the cells isolated from normal tissue (T.M. = 1.056 ± 0.460) (p=0.00001; C.I. 95%: -1.7705 to _1.1808). It was found that the patients at earlier stages of the Dukes and TNM classifications presented higher levels of oxidative damage than did those at more advanced stages (p=0.04 and p=0.001, respectively). Conclusions: The cells obtained from normal tissue of colorectal cancer patients presented signs of oxidative damage to the cell DNA, although at significant lower levels than in the neoplastic cells.
Key words: Oxidative stress, Oxidants, Comet assay, Colorectal neoplasia.
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Endereço para correspondência:
Carlos Augusto Real Martinez
Rua José Raposo de Medeiros, 474 apto. 62.
Bragança Paulista - São Paulo
12914-450
Tel.: (11) 4438-9203
E-mail: caomartinez@uol.com.br
Recebido em 06/09/2007
Aceito para publicação em 23/10/2007
Trabalho realizado no Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade São Francisco, Bragança Paulista, São Paulo.