ARTIGOS ORIGINAIS
EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS P53 E COX-2 EM ADENOCARCINOMA INTESTINAL E MUCOSA ADJACENTE
Expression of p53 and Cox-2 Proteins in Intestinal Adenocarcinoma and Adjacent Mucosa
Carlos Roberto Felin1,2,3; Adriana Brondani da Rocha1,4,5; Izabella Paz Danezi Felin1,6; Andréa Regner1,4,5; Ivana Grivicich1,4,5
1 Programa de Pós Graduação em Genética e Toxicologia Aplicada, Universidade Luterana do Brasil, Canoas, RS, Brasil; 2Hospital da Brigada Militar de Santa Maria, RS, Brasil; 3Hospital Universitário da Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brasil; 4Programa de Pós Graduação em Diagnóstico Genético e Molecular, Universidade Luterana do Brasil, Canoas, RS, Brasil; 5Laboratório de Marcadores de Estresse Celular, Centro de Pesquisas em Ciências Médicas, Universidade Luterana do Brasil, Canoas, RS, Brasil; 6Departamento de Patologia, Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil.
RESUMO: Este estudo teve como objetivo verificar se existe associação entre o estadiamento do tumor e a expressão das proteínas p53 e Ciclooxigenase-2 (Cox-2) em adenocarcinoma de intestino. Foi realizado um estudo retrospectivo de 40 blocos de parafina contendo amostras obtidas de ressecção cirúrgica de tecido intestinal anteriormente diagnosticado como adenocarcinoma de intestino humano. O material foi coletado no período entre 1998 e 2003 no Hospital Universitário de Santa Maria, RS, Brasil. Como controle, foram utilizadas amostras de áreas não tumorais de mucosa adjacente, referentes a cada caso (n = 40). Utilizamos a imuno-histoquímica para analisar este material quanto à expressão das proteínas p53 e Cox-2. A expressão das proteínas p53 e Cox-2 foi significativamente maior em tecido tumoral quando comparada com mucosa adjacente. Detectamos positividade total para Cox-2 (100%), e parcial (70%) para p53 em tecido tumoral. Foi verificada associação significativa entre expressão da proteína p53 e estadiamento segundo Astler-Coller, mas não com a classificação TNM. Quanto à proteína Cox-2, não foi observada associação significativa com estadiamento do tumor de intestino. Os achados sugerem que existe uma tendência entre a expressão da proteína p53 e Cox-2 com o estadiamento do tumor, sendo necessária comprovação com estudos futuros.
Descritores: Adenocarcinoma de intestino, Proteína p53, Proteína Cox-2, Imuno-histoquímica, Estadiamento tumoral.
INTRODUÇÃO
O carcinoma de intestino é um dos
tumores malignos mais comuns no ocidente, correspondendo
a terceira causa de morte por
câncer1. Mais de 80% desses tumores são esporádicos, sendo que os
fatores ambientais e dietéticos parecem ser variáveis de
grande valor no desenvolvimento desta neoplasia. A
história familiar para o câncer intestinal é observada
em até 25% dos casos, e algumas situações como
presença de adenomas, constituem risco de
desenvolver adenocarcinoma
intestinal2,3,4.
O diagnóstico do câncer colorretal pode
ser suspeitado pela história clínica de enterorragia ou
sangue oculto nas fezes, dor abdominal, emagrecimento,
e confirmado pela endoscopia baixa seguida de biópsia
e anatomopatológico1. Existem fatores prognósticos
para o câncer colônico que estão diretamente
relacionados ao sistema pTNM de
estadiamento5. São estes:
infiltração do tumor na gordura pericólica,
graduação histológica, obstrução, perfuração, aderência do
tumor a órgãos e estruturas adjacentes, invasão
angiolinfática e classificação de Dukes e
Astler-Coller3,4,6. O prognóstico em casos de doença avançada é ruim, e
mais de um terço dos pacientes morrem durante a
progressão da doença7.
Durante a evolução dos tumores de
intestino, do tipo esporádico, vários genes são alterados,
sendo os mais freqüentes: TP53,
k-ras, DCC, APC e
c-myc3,4,8,9. Atualmente vários marcadores
imuno-histoquímicos vêm sendo estudados em relação
à carcinogênese colorretal, entre eles a oncoproteína
p53 e, mais recentemente, a
Ciclooxigenase-210,11.
Quando ocorre dano ao DNA, o gene TP53 selvagem inibe a mitose e induz o reparo, se este
não for eficiente, ele desencadeia apoptose. Assim,
células geneticamente instáveis e com predisposição a
transformação maligna são eliminadas. Entretanto,
quando ocorre uma mutação no gene
TP53, há alteração funcional da proteína p53 que se torna não funcional,
levando a uma instabilidade genética e iniciando a
transformação maligna12. A mutação do
TP53 proporciona acúmulo dessa proteína no núcleo celular, pois a
alteração genética determina uma meia vida mais
longa, podendo ser detectada por
imuno-histoquímica13.
A ciclooxigenase (Cox) é uma enzima
limitante da taxa de conversão do ácido aracdônico
em prostaglandina10. Esta enzima possui duas isoformas
a Cox-1 e a Cox-2. A Cox-1 é expressa
constitutivamente na maioria dos tecidos, e controla atividades
fisiológicas normais. Já a Cox-2 somente se expressa após ser
estimulada por fatores de crescimento, citoquinas
e mitógenos. A Cox-2 é expressa no trato
gastrointestinal em níveis indetectáveis, porém sua expressão é
evidenciada na maioria dos adenomas e eleva-se
significativamente no carcinoma
intestinal1,14,15,16. A expressão
desta enzima pode ser um fator prognóstico
independente, cujo nível de expressão tem sido relacionado ao
desenvolvimento de metástases à distância, recorrências,
menor sobrevida e grau de invasão
vascular10.
Neste estudo, avaliamos se existe
associação entre a expressão das proteínas p53 e Cox-2 com
o estadiamento do adenocarcinoma intestinal.
MÉTODOS
Seleção de casos
Foram escolhidos blocos de parafina (n = 40) contendo fragmentos de tecido intestinal
anteriormente diagnosticado como adenocarcinoma de
intestino humano. Todos provenientes do arquivo do Serviço
de Patologia do Hospital Universitário de Santa
Maria (HUSM), RS, Brasil, referentes aos exames histopatológicos rotineiros realizados no período
entre 1998 e 2003. Para controle, amostras de áreas
não tumorais de mucosa adjacente, referentes a cada
caso, foram incluídas no estudo (n = 40).
Como critério de inclusão consideramos a
existência e a conservação de todos os blocos de
parafina referentes a cada caso no período de tempo
destinado ao estudo. Foram considerados critérios de exclusão
a má conservação dos blocos de parafina, arquivo
incompleto, dúvidas diagnósticas, outros diagnósticos,
produtos de biópsias e casos fora do período estipulado.
O protocolo experimental foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres
Humanos e Animais da Universidade Luterana do Brasil ,
Canoas, RS, Brasil (protocolo CEP-ULBRA 2006-256H).
Processamento histológico
Foram obtidos de todos os blocos cortes histológicos com 4 øm de espessura, montados em
lâminas histológicas tratadas com silano (4%) e
coradas com hematoxilina e eosina para
reavaliação histopatológica.
A revisão histopatológica em todos os
casos foi realizada por dois patologistas experientes, de
forma independente, sem identificação dos casos.
Eventuais resultados conflitantes foram discutidos
pelos mesmos para definição consensual da análise.
Procedeu-se graduação, estadiamento
pTNM e caracterização de itens relativos ao preenchimento
de um instrumento recomendado para adenocarcinoma
coloretal17, adotado pelo Serviço de Patologia do HUSM.
Imuno-histoquímica
Utilizando a técnica de
imuno-histoquímica, foram testadas, em todos os casos de
adenocarcinoma de intestino e mucosa adjacente, a
imunorreatividade da proteína p53 utilizando o sistema
EnvisonTM (Dako, EUA), e para a proteína Cox-2, foi
utilizado o método da avidina-biotina-peroxidase (ABC)
(Vector Laboratories, EUA) com
modificações8.
As lâminas contendo tecido intestinal
foram desparafinizadas em xilol, hidratadas em álcool etílico
absoluto, tratadas com tampão citrato (pH 6,0) para
a reativação do antígeno e lavadas em solução
salina tamponada. Após, as lâminas foram tratadas com
peróxido de hidrogênio
(H2O2) a 3% por cinco minutos, para
bloqueio da peroxidase endógena. A seguir os tecidos
foram incubados com os respectivos anticorpos primários
p53 (anticorpo monoclonal de camundongo, clone
D07, DAKO-EUA, 1:1800) e Cox-2 (anticorpo monoclonal
de camundongo, Cayman Chemical Company-EUA;
1:100), overnight a 4oC. Posteriormente, os cortes foram
incubados com o anticorpo secundário biotinilado por 60
minutos, e durante 45 minutos, no caso do sistema
EnvisionTM.
A revelação dos anticorpos foi realizada
através da reação da enzima peroxidase visualizada
pela coloração com DAB ((3-3)-tetrahidrocloreto
de diaminabenzidina), contra-corados com hematoxilina
de Harris e analisados em microscópio óptico.
Análise imuno-histoquímica
A imunocoloração da proteína p53 foi
considerada positiva quando observamos mais de 10% de
células imunomarcadas com reatividade nuclear para
p53. O controle positivo para a imunolocalização da
proteína p53 foi feito com uma amostra de carcinoma
de mama. Controles negativos foram obtidos pela
omissão dos anticorpos
primários14,19.
Os critérios utilizados para avaliação da
Cox-2 foram: Negativo = ausência de reatividade;
Positivo 1+ = reatividade fraca; Positivo 2+ = reatividade
moderada e Positivo 3+ = reatividade intensa. Foi
utilizado como controle positivo uma amostra de
carcinoma de mama com reatividade intensa a Cox-2 (3+).
Análise estatística
A análise estatística dos resultados
da imunorreatividade das proteínas p53 e Cox-2 e sua
associação com o estadiamento do tumor foi obtida
com o emprego do teste qui-quadrado de associação.
Para a comparação da expressão das proteínas entre o
tecido normal e o tecido tumoral empregou-se o teste
exato de Fischer. Para todos os testes foi utilizado
o software GraphPad Instat (versão 3.05,
GraphPad Software Incorporation, San Diega, CA, USA).
RESULTADOS
Características da amostra de adenocar-cinoma de intestino
Foram estudados 40 casos de adenocarcinoma de intestino, 28 (70 %) em mulheres e 12 (30 %)
em homens, predominantemente dos 61 aos 80 anos
(55 %). Com relação à localização do tumor houve
predomínio do cólon descendente (n = 38 %).
A maioria dos tumores correspondeu a adenocarcinoma moderadamente (n = 26; 65%) ou
bem diferenciados (n = 23; 32%). Em 75% da amostra
a avaliação da invasão vascular foi ausente; e 92,5
% dos casos não apresentaram invasão perineural
(Tabela 1).
Expressão imuno-histoquímica de p53
e Cox-2 em tecido normal e tumoral
Foi observada hiperexpressão de p53 em
28 das 40 amostras de adenocarcinoma (70 %) e reatividade Cox-2 3+ em 100 % dos casos,
representando diferença estatisticamente significante do
tecido normal (p<0.0001) em relação aos marcadores p53
e Cox-2 (Tabela 2).
Associação entre estadiamento
segundo TNM e Astler-Coller com marcadores p53 e Cox-2
Não foi observada diferença significativa
ao considerarmos a associação entre hiperexpressão
de p53 e estadiamento segundo TNM, apesar da maioria (27,5 %) ser classificada como estágio IIIC
(Tabela 3). Quinze casos (37,5 %) dos
adenocarcinomas com hiperexpressão para p53, encontravam-se
no estágio C2, segundo Astler-Coller, representando
associação estatística significativa entre p53
e estadiamento segundo Astler-Coller (p=0.0244)
(Tabela 3).
DISCUSSÃO
O conhecimento do maior número de
variáveis diretamente associadas ao prognóstico dos
tumores intestinais torna-se necessário para a
melhor identificação de pacientes que poderão se
beneficiar de tratamentos
complementares20. A ressecção
cirúrgica continua sendo a modalidade terapêutica
mais efetiva para o tratamento desta neoplasia em
fases iniciais. Em contraste, nos pacientes em que a
cirurgia não é o tratamento de escolha, é fundamental
a utilização de fatores prognósticos para melhor
compreender a história natural do tumor e definir a
melhor terapia21.
No nosso estudo , a população avaliada
tinha entre 61 a 80 anos, sendo a idade média 61,8
anos, semelhante ao encontrado na
literatura22,23, mostrando prevalência da doença em pessoas acima de 50
anos. O adenocarcinoma foi significativamente mais
freqüente no cólon descendente (95 % dos casos),
semelhante ao relatado anteriormente22.
A marcação imuno-histoquímica foi
maior, de uma maneira geral, em casos III-C uma vez
que 100 % dos III-C foram positivos para p53 e
para Cox-2 (9 % positivo 2+ e 91 % positivo 3+).
Além disso, 100 % dos casos III-B foram positivos
para p53 e Cox-2 3+. Este fato é concordante com
estudos que relacionam p53 e Cox-2 com pior
prognóstico1,12,24,25. Neste estudo foi possível
observar que proporcionalmente à progressão
do estadiamento houve aumento da expressão
destes marcadores, apesar destes dados não
demonstrarem diferença significativa.
Quando fizemos a associação entre
os marcadores e a classificação segundo
Astler-Coller, observamos uma prevalência na classificação
C2. Destes, 100 % foram positivos para p53 e Cox-2 (93,3 % Cox-2 positivo 3+ e 6,6 % Cox-2
positivo 2+). Esta observação parece estar relacionada a
um pior prognóstico na medida em que a expressão
da p53 e Cox-2 aumentam de acordo com a imaturidade das células tumorais. Estes achados são
concordantes com vários estudos encontrados na
literatura1,9,12,18,24,26,27,28,29,30,31,32
. Destaca-se que em estágio mais adiantado, estágio D de Dukes e D
de Astler-Coller, foi observado um discreto
decréscimo na marcação p53, enquanto a marcação
Cox-2 se manteve com 100 % de positividade.
Na maioria das associações realizadas
houve concordância de expressão entre p53 e Cox-2,
sugerindo mais estudos que abordem a expressão da
Cox2 e da p53 como fatores interligados. Tais achados
encontram concordância na literatura, uma vez que
vários oncogenes, fatores de crescimento e promotores
de tumor podem apresentar a capacidade de induzir a
expressão de Cox-2 em células malignas. Além disso,
o p53 selvagem é capaz de suprimir a transcrição do
Cox-2, sugerindo que o p53 é, também, um
determinante para a expressão do Cox-2. Este, por sua vez,
pode gerar efeitos na proliferação celular e no
prognóstico, aumentando o potencial metastático de células
malignas1,10.
Embora estes achados não possam suportar
a hipótese de associação entre os marcadores p53 e
Cox-2 com o estadiamento do tumor de intestino, sua
contribuição é relevante para futuros estudos por
apontar relações de extrema importância em torno
destes marcadores como fatores prognósticos.
ABSTRACT: The objective of this study is to establish a possible association between staging and the expression of p53 and cyclooxygenase-2 (Cox-2) proteins in intestinal adenocarcinoma. A retrospective study of 40 embedded paraffins with surgical specimens of intestinal Adenocarcinoma was performed. The samples were collected during 1998 and 2003 at Hospital Universitário de Santa Maria, RS, Brasil. Samples of non-tumoral tissues (n = 40) were used as a negative control. The expression of p53 and Cox-2 was immunohistochemically studied. The expression of p53 and Cox-2 proteins was significantly higher in the tumor material when compared to the normal adjacent mucosa. Cox-2 expression was found in 100% of tumoral cases, while p53 expression was noted in 70% of tumor blocks. There is significantly association between the expression of p53 protein and Astler-Coller staging, but no with TNM-stage. There was no significant correlation between Cox-2 expression and intestinal adenocarcinoma staging. Our findings suggest that the expression of p53 and Cox-2 proteins could have association with Astler-Coller staging.
Key words: Intestinal adenocarcinoma, p53 protein, Cox-2 protein, Immunohistochemistry, Tumor staging.
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Endereço para Correspondência:
Ivana Grivicich
Laboratório de Marcadores de Estresse Celular, Centro de
Pesquisas em Ciências Médicas, Universidade Luterana do Brasil
Av Farroupilha, 8001, Prédio 22, 5o andar, Canoas, RS, Brasil
CEP: 92245-900
Tel: +55-51-34779219
E-mail: grivicich@terra.com.br
Recebido em 14/01/2008
Aceito para publicação em 18/02/2008
Trabalho realizado no Laboratório de Marcadores de Estresse Celular, Centro de Pesquisa em Ciências Médicas, Universidade Luterana do
Brasil - Rio Grande do Sul - Brasil.