ARTIGOS ORIGINAIS
PROCESSO INFLAMATÓRIO EM MUCOSA DE RESERVATÓRIOS ILEAIS DE DOENTES ASSINTOMÁTICOS
Inflammatory Activity of Pelvic Ileal Pouches Mucosa in Asymptomatic Patients
Raquel Franco Leal1; Maria de Lourdes Setsuko Ayrizono2; Marciane Milanski3; João José Fagundes4; Andressa Coope3; Sandro Nunes Ângelo5; Lício Augusto Velloso6; Cláudio Saddy Rodrigues Coy4
1 Mestre em Cirurgia, Residência Médica em Coloproctologia pela Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP); 2 Professor Doutor, Grupo de Coloproctologia - DMAD - UNICAMP; 3 Pós-graduação em Clínica Médica pela UNICAMP; 4 Professor Livre Docente, Grupo de oloproctologia, DMAD-UNICAMP; 5 Mestre em Cirurgia - Grupo de Coloproctologia, DMAD - UNICAMP; 6 Professor Associado, Departamento de Clínica Médica, FCM-UNICAMP.
RESUMO: A inflamação inespecífica do reservatório ileal (RI) após retocolectomia total é a complicação pós-operatória mais comum nos doentes operados por retocolite ulcerativa inespecífica (RCUI). Os mecanismos imunológicos envolvidos na etiologia não são totalmente conhecidos. Objetivo: Avaliar a ativação de STAT-1 e a expressão da citocina INF-g em mucosa de RI endoscópica e histologicamente normal, de doentes operados por RCUI e PAF, assintomáticos. Casuística e Método: Estudou-se 18 doentes submetidos à retocolectomia total com RI em "J", sendo nove com RCUI e nove com polipose adenomatosa familiar (PAF). Realizou-se biópsias da mucosa dos RI e de íleo terminal. As expressões de INF-g e a ativação de STAT-1 foram avaliadas por meio de imunoblot de extrato protéico total. Resultados: A ativação de STAT-1 foi maior em mucosa de RI de doentes operados por RCUI, quando comparada aos grupos PAF e Controle (p<0.05). A expressão de INF-g foi maior no grupo RCUI quando comparada ao grupo Controle (p<0.05), mas não em relação ao grupo PAF (p>0.05). Conclusão: Estes achados podem justificar a maior susceptibilidade dos doentes com RCUI à inflamação inespecífica do RI quando comparados aos portadores de PAF, sendo a principal via inflamatória similar à verificada na RCUI.
Descritores: Retocolite ulcerativa, polipose adenomatosa familiar, reservatório ileal, bolsa ileal, bolsite, citocinas.
INTRODUÇÃO
Retocolectomia total com confecção do
reservatório ileal (RI) é o procedimento de escolha para
doentes com retocolite ulcerativa inespecífica (RCUI)
com intratabilidade clínica, e para aqueles com
polipose adenomatosa familiar (PAF) que apresentam, em
geral, mais que vinte pólipos
retais.1,2,3,4,5,6 Entretanto, a inflamação inespecífica primária do RI ("bolsite") é uma
das complicações mais comuns após este procedimento
principalmente em RCUI, atingindo até 60% de
ocorrência, enquanto que apenas 5% dos portadores de PAF a
apresentam.7,8,9,10,11 A etiologia não é totalmente
esclarecida e o diagnóstico é clínico, porém deve ser
confirmado pelos achados endoscópicos e
histológicos.12-22
A diferença da incidência de "bolsite" entre
os doentes com RCUI e PAF tem levado alguns autores
à hipótese de que possa haver similaridade entre
esta complicação e a própria doença inflamatória
intestinal de base. 23,24
As citocinas pró-inflamatórias e as vias de
sinalização celular envolvendo o grupo de
proteínas ativadoras de transcrição nuclear (STAT)
apresentam papel importante na etiopatogenia da RCUI.
Especificamente, níveis elevados de
Interferon-ã (INF-g) e STAT-1 foram detectados em amostras de mucosa
intestinal de doentes portadores de doença
inflamatória intestinal, particularmente em
RCUI.25-30 No entanto, poucos estudos têm avaliado o processo
inflamatório em mucosa de RI com ileíte do reservatório e nas
condições de doentes
assintomáticos7,31-37, e
determinado se há correlação com a
RCUI.38-42
Assim, com a finalidade de avaliar o processo inflamatório em mucosa de RI de doentes
operados por RCUI e PAF com o trânsito íleoanal
reconstruído, assintomáticos, determinou-se a expressão da
citocina pró-inflamatória IFN-g e do fator de transcrição
nuclear do TNF-a, STAT-1, comparando-os nas
condições de doença acima citadas, e em grupo controle.
CASUÍSTICA E MÉTODOS
Biópsias de mucosa de RI foram obtidas de
nove doentes portadores de RCUI assintomáticos, com
média de idade de 48,7 (31-63) anos, sendo 55,6% do
sexo feminino, e de nove portadores de PAF,
também assintomáticos com média de idade de 33,8 (21-59)
anos e 55,6% do sexo feminino. O tempo de seguimento
pós-operatório foi de 73,1 (24-168) meses. Os
reservatórios ileais foram do tipo "J", e a arcada vascular do
cólon direito foi preservada como complementação à
irrigação sanguínea do íleo
terminal.43 A mucosectomia foi realizada e a anastomose íleo-anal foi
confeccionada manualmente. Os pacientes haviam sido submetidos
à reconstrução de trânsito, com fechamento da
ileostomia de proteção há mais de um ano. A ausência de ileíte
do RI foi observada clinicamente, além da
análise endoscópica e histológica realizada de acordo com
o Índice de Atividade da Ileíte do RI, proposto por
Sandborn e col 20. O grupo controle foi composto por nove
indivíduos com íleo-colonoscopia normal, sendo a média
de idade de 40,9 (26-58) anos e 55,6% do sexo
feminino. As biópsias foram obtidas do íleo distal.
O estudo foi realizado pelo Grupo de Coloproctologia e Laboratório de Sinalização
Celular da Universidade Estadual de Campinas e aprovado
pelo comitê de ética local registrado sob
no 543/2005 com adendo em 2007. Todos os pacientes assinaram o
termo de consentimento informado.
Fragmentos de íleo do RI e de íleo
terminal foram congelados em nitrogênio líquido, e
armazenados a -80oC, no Laboratório de Sinalização Celular
- FCM UNICAMP, para posterior homogeneização
em tampão de imunoprecipitado contendo 1% de
Triton X 100, 100mM de Tris (ph 7,4), 100mM de
pirofosfato de sódio, 100mM de fluoreto de sódio, 10mM
de EDTA, 10mM de vanadato de sódio, 2mM de
PMSF e 0,1mg/ml de aprotinina a 40C. O homogeneizado
foi então centrifugado à 11.000 rpm por 20 minutos.
No sobrenadante foi determinada a concentração de
proteína utilizando o método de Bradford
44, e posteriormente preparou-se amostra contendo 100ìg para
separação por SDS-PAGE. As amostras foram
diluídas em tampão de Laemmli, contendo 100mmol/L
de DTT. Após rápida fervura, foram aplicadas em
gel de poliacrilamida para separação por
eletroforese (SDS-PAGE). As proteínas separadas em
SDS-PAGE foram transferidas para membrana de nitrocelulose, em aparelho de transferência da
BIO-RAD. A membrana de nitrocelulose foi incubada "overnight" com 10ìl de anticorpo específico
(anti-IFN-g, anti-STAT-1). A ligação do anticorpo a
proteínas não-específicas foi minimizada pela
pré-incubação da membrana de nitrocelulose com
tampão de bloqueio (5% de leite em pó desnatado; 10
mmol/L de Tris; 150 mmol/L de NaCl; 0,02% de Tween 20) por 1,5
hora.45,46
Os reagentes para separação das proteínas
em gel de poliacrilamida e imunoblot foram da
Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA). Aprotinina, Triton
X-100, Tween 20, glicerol foram adquiridos da Sigma (St.
Louis, MO). O papel de nitrocelulose (BA85,
0.2ìm) foi da Amersham (Aylesbury, UK). Os anticorpos
anti-phospho-STAT-1 (sc-7988, goat policlonal) e
anti-IFN-ã (sc-9344, goat policlonal) foram adquiridos da
Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA).
O sinal foi detectado por meio de reação
de quimioluminescência utilizando os reagentes
da SuperSignal®West Pico Chemiluminescent
Substrate da Pierce Biothecnology, Inc. Rockford. As
bandas autoradiografadas foram quantificadas por meio
de densitometria óptica (Gel-Pro Analyzer 3.1 software
- Exon-Intron Inc., Farrell, MD).
Os resultados foram notificados como
média com variação do erro padrão. Utilizou-se análise
de variância, seguida de teste de Tukey-Kramer para
comparações múltiplas de médias. Nível de
significância de p<0,05.
RESULTADOS
A análise das bandas auto-radiografadas
por meio de densitometria óptica mostrou os seguintes
dados arbitrários em relação à expressão de
IFN-g e à ativação de STAT-1 nos diferentes grupos (RCUI,
PAF e Grupo Controle), conforme as figuras ao lado.
Figura 1 - Expressão de INF-g em mucosa de reservatório
ileal normal dos Grupos Controle, PAF e RCUI. Para todas as condições, n=09, *p<0.05 vs Control; § p<0.05 vs FAP. |
Figura 2 - Ativação de STAT-1 em mucosa de reservatório
ileal normal dos Grupos Controle, PAF e RCUI. Para todas as
condições, n=09, *p<0.05 vs Control; § p<0.05 vs FAP. |
ABSTRACT: Pouchitis after total retocolectomy is the most common complication in ulcerative colitis (UC). The immunological mechanisms involved in the genesis of pouchitis are unclear. Purpose: To evaluate STAT-1 activation and IFN-ã expression in normal ileal pouch mucosa. Methods: Eighteen asymptomatic patients submitted to total retocolectomy and J pouch, were evaluated, being nine with UC and nine with FAP. The activation of STAT-1 and expressions of the cytokine were determined by immunoblot of total protein extracts from pouch mucosal biopsies. Results: STAT-1 activation was increased in UC, when compared to FAP and controls. Higher levels of IFN-g expression were observed in UC when compared to control group, but was similar to FAP. Conclusions: These findings could explain a higher susceptibility to this inflammatory complication in UC when compared to FAP, which may be similar to UC disease.
Key Words: Ulcerative colitis, familial adenomatous polyposis, ileal pouch, pouchitis, cytokines.
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Endereço para correspondência:
Raquel Franco Leal
Rua Patativa, no 170, apto 24C
Bonfim - CEP 13034-810
Campinas, São Paulo
Tel. -19-32844803
raquelleal@mpc.com.br
ccoy@terra.com.br
Recebido em 17/09/2008
Aceito para publicação em 29/10/2008
Trabalho realizado pelo Grupo de Coloproctologia, Disciplina de Moléstias do Aparelho Digestório, (DMAD), Faculdade de Ciências
Médicas, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, São Paulo, Brasil. Laboratório de Sinalização Celular, Departamento de
Medicina Interna, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, São Paulo, Brasil.